蛋白表达的常见问题

　　蛋白表达实验的时，有时候实验会觉得参考实验方法和克隆的蛋白基因序列完q没有问题，但蛋白电泳就是没有结果。那么你知道蛋白表达的常见问题有哪些吗？让我们一起来看看吧！

　　1、载体构建错误，很多克隆新人常常弄错读码框。比如Qiagen的pQE系列载体，其复制位点常有一两个碱基的差异；另外有些酶产生粘端有些酶产生平端，这些都容易导致读码框错误，从而无法表达出来。

　　2、宿主菌选择不当。不同的宿主菌其基因型是不同的。有些经过特殊修饰的载体，或者特殊用途的载体，或者有特殊启动子的载体，必须选择适合的宿主菌进行表达。因此，当你的蛋白没有表达出来时，可以考虑更换宿主菌。

　　3、密码子的使用频率较低。有些基因其本身含有许多罕见密码子，尤其是起始密码之后的15个碱基之内的罕见密码子，对蛋白表达有着很重要的影响。优化密码子对原核表达似乎效果很好，对真核表达系统未必有很好的效果。

　　4、质粒不稳定或者质粒丢失。pET系统通常相对较稳定。但是你选用带氨苄青霉素抗性的载体时，也许有可能产生β-lactamase降解了抗生素，使质粒丢失。还有一种情况是表达重组的毒素蛋白，对宿主细胞也具有毒性，导致质粒丢失。这种情况在真核表达系统中较为常见。

　　5、蛋白酶将蛋白降解了。这种情况通常由重组蛋白本身的N-或C-端序列引起。当蛋白N-端是Arg,Leu,Lys,Phe,Trp,或Tyr这些氨基酸时，容易受到蛋白酶降解，这就是所谓的N-末端规则。如果N-端是Met时，大肠杆菌可以偷偷地将这个Met去掉，尤其是Met之后紧跟着一个带有小侧链的氨基酸时。而C-末端存在非极性氨基酸时，也容易导致蛋白被降解。如果C末端最后5个氨基酸是极性的或者带电荷的，则不容易被降解。

　　6、二级翻译起始位点。这种情况出现在你的序列中恰好包含与核糖体结合位点完q相同的序列。那就怪不得了，核糖体会非常高兴地找到这个位点，然后开始翻译，导致你的蛋白被截短，在电泳时无法看到预期大小的片段。

　　更多有关蛋白表达的常见问题，请联系北京百奥创新科技有限公司！