PCR反应体系包括什么

　　PCR是一种选择性体外快速扩增DNA片段的方法。在体外以类似于细胞内DNA的半保留复制过程，以拟扩增的模板DNA分子，与模板DNA互补的寡核苷酸引物、DNA聚合酶、4种dNTP及适合的缓冲体系组成的反应体系，经过重复地变性一退火一延伸三步，扩增新的目的DNA链，这个过程通过控制反应体系的温度来实现。那么你知道PCR反应体系包括什么吗？让我们一起来看看吧！
 

　　一、模板(template)
 

　　模板即扩增用的DNA，可以是任何来源DNA(如基因组DNA、质粒DNA等)或RNA(如总RNA、mRNA、tRNA、rRNA、病毒RNA等)，但必须符合两个条件：一是纯度必须较高，二是浓度不能太高以免抑制。模板是待扩增的目的基因或特异片段，如诊断病人是否携带有突变基因时，其模板就是提取的病人血液中的DNA或RNA片段。PCR对模板DNA的纯度不要求很高，但应尽量不含有对PCR反应有抑制作用的杂质存在，如蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制剂、能与DNA结合的蛋白质。
 

　　二、引物(primers)
 

　　人工合成的一对引物可以分别与两条模板DNA互补结合的寡核苷酸序列，其中一条称为上游引物，另一条称为下游引物。引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。引物浓度一般为0.1~0.5umol/L，浓度过高会引起错配和非特异扩增，浓度过低则得不到产物或产量过低。引物长度一般为15~30bp,引物过长或过短都会降低特异性。其3'末端一定要与模板DNA配对，末位碱基最好选用A、C、G(因T错配也能引发链的延伸)。引物GC占45%~55%，碱基应尽量随机分布，避免嘧啶或嘌呤堆积，两引物之间不应有互补链存在，不能与非目的扩增区有同源性。
 

　　三、底物(dNTP)
 

　　dNTP包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1mol/L NaOH或1mol/L Tris-HCl的缓冲液将其pH调节至7.0~7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。一般存储浓度为10mo/L，各成分以等当量配制，反应终浓度为20~200umol/L，如其中任何一种浓度不同于其他几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。高浓度可加速反应，但同时增加错误掺入和实验成本；低浓度可提高精确性，而反应速度会降低。
 

　　四、PCR缓冲液(PCR buffer)
 

　　缓冲液的成分最为复杂，除水外一般包括四种有效成分：①缓冲体系，一般使用HEPES或MOPS缓冲体系；②一价阳离子，一般采用钾离子，但在特殊情况下也可使用铵根离子；③二价阳离子，即镁离子，根据反应体系确定，除特殊情况外不需调整；④辅助成分，常见的有DMSO、甘油等，主要用来保持酶的活性和帮助DNA接触缠绕结构。
 

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