內溶素的克隆、诱导表达与纯化

简介

作为噬菌体衍生的酶，内溶素本质是一种蛋白分子，其通过分解细菌细胞壁的肽聚糖成分，帮助噬菌体颗粒从细菌宿主释放，可在噬菌体复制过程中表达，破坏细菌细胞壁肽聚糖的关键化学键。

原理

通过内溶素的蛋白表达、纯化能够将内溶素基因克隆到表达载体（如 pET28a），进一步转化大肠杆菌进行扩增，重组质粒经 IPTG 诱导表达，得到经镍柱纯化的内溶素蛋白。

用途

为治疗抗生素耐药的细菌感染提供潜在解决方案。

材料与仪器

仪器：

离心机、超声破碎仪

恒温摇床、恒温培养箱、PCR 仪、电泳仪

凝胶扫描仪、镍柱纯化系统、0.22 μm 滤膜

试剂：

质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒

核酸内切酶、T4 连接酶、Pfu 聚合酶

IPTG、考马斯亮蓝

步骤

（1）内溶素的克隆

1、引物设计：对待研究的内溶素完成基因组测序注释工作，根据已测基因组进行引物设计 P1 与 P2，并引入酶切位点。

2、PCR 扩增内溶素基因：反应体系与程序见表 1。

3、PCR 反应条件：95 ℃ 预变性 5 min，95 ℃ 变性 30 s，Tm 温度下退火30 s，72 ℃ 延伸 30 s，共 30 个循环，72 ℃ 最后延伸 10 min，26 ℃ 再反应 2 min（终止反应）。

4、回收 PCR 产物胶：进行琼脂糖凝胶电泳，将 50 μL 全部上样，切下目的基因条带，使用胶回收试剂盒回收目的基因（一般实验室都会有常用品牌）。

5、抽提质粒：使用质粒抽提试剂盒抽提载体质粒（一般实验室都会有常用品牌）。

6、对位点进行酶切：利用一开始设计好的酶切位点对载体与目的基因进行双酶切，在 37 ℃ 下反应 3 h。

7、切胶回收：将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切取含 DNA 片段的目的条带并进行回收，得到 DNA 后检测其浓度并保存在 -20 ℃ 冰箱备用。

8、DNA 与载体连接：用 T4 连接酶连接载体与 DNA 片段，在 16 ℃ 下过夜。

9、转化大肠杆菌：取 50 μL 大肠杆菌 BL21 感受态细胞，加入 5 μL 连接液后冰上孵育 30 min，摇匀后 42 ℃ 水浴热休克 90 s，然后迅速冰浴 2 min，冰浴后再加入已经预热的 1 mL LB 培养基，37 ℃ 摇床震荡 1 h 复苏，最后涂板至卡那霉素抗性的平板，37 ℃ 温度下培养过夜。次日挑取单菌落进行菌落 PCR，将阳性菌落接种于培养基中 37 ℃ 温度下培养过夜。

10、抽提质粒并进行双酶切验证（参见 5、6 步）。

（2）内溶素的表达与纯化

1、少量诱导表达：挑选单菌落过夜培养，过夜菌接种至 1 mL 培养基，37 ℃ 培养 2~3 h，再加入 10 μL 0.1 M 的 IPTG 在 16 ℃ 诱导 4 h，取 20 μL 菌液加入 7.5 μL 的蛋白缓冲上样液，100 ℃ 沸水煮 10 min 后电泳，倒入考马斯亮蓝过夜震荡，清洗后寻找发现目标蛋白条带存在，进一步扩大培养。

2、扩大培养：将阳性菌落涂布平板过夜，挑选单菌落接种至 10 mL 培养基，37 ℃ 培养 6 h，按  1:100 比例接种于 500 mL 培养液中，37 ℃ 摇床至 OD600 值为 0.6~0.8，加入终浓度为 1 mM 的 IPTG 诱导剂，在 16 ℃ 下继续培养 12 h。

3、细胞破碎：菌液离心 10 min（4000 g，4 ℃），重悬于 30 mL PBS，加入 PMSF 和 tritonX-100 冰浴 1 h 后超声破碎，破碎菌液在 4 ℃ 转入 50 mL 离心管，12000 rpm 离心10 min，取上清液用 0.22 μm 滤膜过滤杂质。

4、蛋白纯化：采用 Ni-NTA 纯化系统进行镍柱亲和层析纯化目的蛋白，纯化后跑电泳，分析蛋白纯度。

注意事项

1. PCR 条件与程序需要根据实验进行梯度摸索。

2. T4 连接酶在高温不稳定，通常 16 ℃ 连接过夜，在 25 ℃ 左右的室温能维持七八个小时。

常见问题

蛋白诱导表达效果不好（蛋白诱导表达条件并不一定适用所有实验室，需要自己做实验摸索条件）。

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