免疫印迹法（WB）抗体纯化的原理、步骤与注意事项

原理

免疫印迹法（Western Blot，WB）是一种通过识别蛋白质的特定抗原性进行检测和分析的方法，可用于抗体纯化。在免疫印迹法中，通过利用蛋白质的亲和性和特异性，将抗血清中的待纯化抗体与其所特异结合的抗原分离出来。

用途

降低非特异性本底。

材料与仪器

免疫抗原、抗血清、PVDF 膜、电泳胶

电泳液、转膜液、预染蛋白 Marker

5% 脱脂牛奶、PBST、电泳仪、电转槽、摇床

步骤

利用 western blot 进行抗体纯化的步骤如下：

1、上样蛋白准备。将免疫抗原作为上样蛋白进行备样，设置 3 个不同浓度的上样量（2 ug、4 ug、6 ug），以便后续可通过不同量的蛋白泳道孵育出的深浅不同验证抗体特异性。

2、点样及电泳。根据免疫抗原的分子量大小配置适合的电泳胶（8%～15%），以能明确看到免疫抗原位置为准，进行电泳。120 V 恒压，90～120 min 至蓝色指示带跑到接近胶板下缘。

3、转膜。先把胶用划刀裁至合适大小，再根据胶大小裁剪合适的 PVDF 膜，手不要接触转膜纸，将毛毡垫、吸水棉分放在夹板两边，将胶放在黑色夹板上面，上面覆上 PVDF 膜，赶尽气泡，夹紧后放入转膜盒。将整个转膜设备放入预先备好的冰块的盆中。设置条件：350 mA 恒流 90 min。

4、封闭。转膜结束后，将 PVDF 膜取出放在 5% 脱脂牛奶中封闭 1 小时。用 PBST 漂洗 3 次，每次 5 min。

5、孵育一抗。这里用抗血清作为一抗进行孵育，建议进行 1:100 稀释后使用， PVDF 膜浸润，摇床 4 ℃ 过夜。第二天 PBST 漂洗 3 次。

6、孵育二抗。加入 1:3000 稀释的 HRP 标记的羊抗兔 IgG 二抗将 PVDF 膜充分浸润，室温孵育 1 小时，漂洗 3 次。

7、显影。将显影液按比例预先混合好，PVDF 膜平铺在塑料膜上，蛋白面朝上，将混合好的显影液均匀地滴在上面。利用 Image Quant LAS 4000 mini 显影仪显影。此时如有蛋白条带在免疫抗原位置显示出来，并根据蛋白量的不同有深浅之分，则说明抗血清中抗体滴度高，特异性强。

注意事项

1, 若免疫抗原是自己提纯的蛋白，则要保证蛋白的纯度，尽可能提高蛋白的纯度。

2, 提前搜索目的蛋白的分子量大小，根据分子量大小选择电泳胶的浓度。可以参考 marker 说明书，最好让蛋白跑在胶中间的位置。

3, 转膜的时候注意胶和膜的上下关系，不要转反，如果转反了，即便抗体是好用的，实验结果也是阴性的。

常见问题

1. 免疫抗原一般为人工合成的蛋白，本方法只能说明免疫动物后产生了抗免疫抗原的抗体，并不能说明产生了抗天然蛋白的抗体，如需验证所产生抗体是否可与天然蛋白结合，需将上样液中的免疫抗原更换为天然抗原，纯度不高没有关系，有一定量即可。

2. 抗血清的稀释是为了保证所产生的待测抗体滴度足够高，从而便于后续纯化收集，如只想验证有无，也可以用抗血清原液进行孵育。

3. 如此方法中免疫抗原与抗血清无法结合，可利用 ELISA 进行检测，因为 WB 中的蛋白为线性蛋白，空间结构与天然有所差别，会有影响。

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