凝胶过滤层析实验（GFC）原理、实验步骤及注意事项

原理

分子筛色谱又称凝胶排阻色谱、凝胶过滤和排阻层析，是 20 展来的一种新型的液相层析分离纯化方法。它的分离基础主要根据物质分子大小不同而进行。

分子筛色谱所用的基质我们通常称之为好胶，它是具有立体网状结构且呈珠状的颗粒物质，每个颗粒犹如一个筛子，当将混合物样品加入层析柱进行洗脱时，大分子物质不多孔凝胶基质能进入基质内部而沿颗粒间的空隙随着溶剂流动，由于其流程较短，移动速度快而最先流出柱外;

小分子物质则可以进入颗粒内部，不断地在不同的凝胶颗粒间进入与逸出，速度较蛋白混合物慢，最后流出柱外;对于中等大小的分子来说，它们既能在凝胶颗粒内外分布，也能部分进人颗粒，从而在大分子物质与小分子物质之蛋白质按分间被洗脱。

用途

根据蛋白质分子量大小和形状来分离目的蛋白质。

材料与仪器

试剂：
平衡缓冲液为 10 mmol/L Na2HPO4，/NaH2PO4，1.0 mol/L（Nacl（pH7.4）、SDS-PAGE

材料：层析柱、色谱填料

仪器：pH 计、匀质机、离心机、蛋白纯化仪

步骤

以 100ml 的柱体积实验为例

1、先用去离子水将 AKTA 纯化仪、柱子冲洗干净。

2、用 2 个柱体积 Buffer 平衡柱料。

3、上样：以流速 1±0.2ml/min 的速度上样。

4、再用 Buffer 以流速 1±0.2ml/min 的速度进行冲洗。

5、在 AKTA 纯化仪检测下，当紫外吸收值开始上升时收集洗脱下来的目的蛋白，当紫外吸收值下降至不再变化时停止收集。

6、检测洗脱液中蛋白浓度,参照考马斯亮蓝法测定蛋白浓度标准操作规程操作，根据洗脱液体积，计算出洗脱液中蛋白量。

7、取样电泳，参照电泳仪使用标准操作流程。

注意事项

1. 色谱峰对称性差

出峰上升时，上升缓慢是填料装填过紧，而拖尾是因为装填的太松，此时对称因子及柱效都很差，出现这种情况就要重现装柱。装柱前要了解填料的压缩系数（压缩因子）如 Focurose FF 系列的填料的压缩系数是 1.15，且装完后要测柱效。

2. 柱床有裂缝或干涸等塌柱现象

检测管路及柱床体系是否有泄露或气泡，必要时重现装柱。

3. 分离度差

(1) 样品和选择的填料不匹配

待分离的样品中目标物质和其它杂质的分子量小于 2 倍且都在选择的填料的排阻极限之外或者之内。若样品中目标物质的分子量和其它杂质的分子量小于 2 倍时，建议尝试其它方法分离，反之选择凝胶过滤层析时，填料的选择应根据样品中目标分子的大小选择更加接近（大或小都可以）目标分子排阻极限的填料进行分离。

(2) 柱床装填的效果差

通过测柱效等方式确保柱床装填的满足凝胶过滤层析的过程。

(3) 上样量过大

根据样品中目标物质和杂质的分子差异优化上样量，如脱盐等样品中目标分子和杂质的分子量大于 50 倍时，上样量可以达到柱床体积的 25%，最高不超过 30%，若样品中目标分子和杂质的分子量差异在2-5倍时，通常上样量控制在柱床体积的5%以内。

(4) 流速过快

凝胶过滤的过程流速不宜过快，降低流速在一定程度上可以提高分离度。

(5) 层析填料被污染或老化

随着填料的使用，一些杂质的积累会使层析填料的孔径发生变化（如堵塞，非特异性吸附积累，微生物污染，破碎等），导致其排阻能力发生偏差而影响分离度。此时可对填料进行 CIP 清洗，若清洗后还不能达到分离要求，就要更换新的填料。

(6) 样品自身的问题

常见问题

1、柱填充要均一，决不能出现气泡。在装柱时候要缓慢倒入凝胶，并轻轻敲打柱身赶走气泡。

2、柱上表面要平，平衡柱时间要长一些，让凝胶充分沉积为均一的柱床。

3、上样体积要少，因此最好浓缩样品。

4、柱床上表面不能干燥，要有 1~2cm 流动相覆盖。

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