亲和层析（AC）实验步骤及注意事项

原理

通过生物分子之间的特异性相互作用来分离物质的一种层析方法。包括基于空间结构特异结合的抗原/抗体，酶/底物、底物类似物、抑制剂、激活剂、辅因子，激素/受体，核酸/核酸结合蛋白、互补核酸序列，和基于电子的供体和受体相互作用的金属螯合、嗜硫亲和等。该分离纯化蛋白的方法高效、简单、快速、选择性高。

用途

分离、纯化蛋白

材料与仪器

样品；亲和层析柱；结合缓冲液；洗脱缓冲液。

步骤

①准备层析柱，根据目标蛋白量和填料载量确定柱体积；

② 准备样品，通过过滤或离心除去颗粒性物质，确保样品中不含干扰结合的物质，根据不同的亲和层析类型调整上样缓冲液 pH；

③ 上样前用上样缓冲液平衡柱子或珠子，柱子需根据结合能力强弱确定上样流速；

④ 孵育，对于亲和磁珠需将样品、抗体、珠子 4℃ 孵育一段时间后再进行洗脱；

⑤洗脱，对于组蛋白标签蛋白采用咪唑或低 pH 盐溶液洗脱、对于 GST 融合蛋白采用含 10-20 mM 还原性谷胱甘肽的溶液洗脱、对于金黄色葡萄球菌蛋白 A 采用低 pH 盐溶液洗脱；

⑥ 对于亲和层析柱可以用结合缓冲液重新平衡柱子或用储存液冲洗柱子，再生利用。

注意事项

1、带不同标签的待纯化蛋白要根据标签的差异选择不同的洗脱方法，常用的洗脱缓冲液有高盐洗脱液、低 pH 洗脱液、还原谷胱甘肽洗脱缓冲液、EDTA 洗脱液等；

2、Ni 亲和层析柱可分为 Ni-IDA (螯合三价)和 Ni-NTA (螯合四价)，IDA 载量要比 NTA 高，IDA 与蛋白结合能力弱、稳定性差、Ni易脱落，纯化回收 His 标签蛋白选择螯合镍更稳定、更耐受还原剂、特异性更高的 NTA 层析柱更好；

3、GST 亲和层析的条件更温和、更能保证蛋白活性；

4、纯化回收过程中要添加稳定蛋白的蛋白酶抑制剂、根据亲和原理合理添加金属螯合剂、离子稳定剂和还原剂。

常见问题

1、Ni 柱进行蛋白纯化需要注意什么?

缓冲液中不能有高浓度的电子供体基团、不能有强螯合剂、不能有高浓度强还原剂、不能含离子型去垢剂、避免含碳酸氢钠等物质；

2、GST 蛋白纯化需要注意什么？

避免蛋白样品超声太剧烈或时间过长引起的蛋白变性，增加洗脱缓冲液的 pH 值可在不增加还原谷胱甘肽浓度的情况下提高洗脱效率；

3、Protein A 纯化蛋白需要注意什么？

要保证 Protein G 和抗体有充分的结合时间，抗体纯度不够会导致杂蛋白含量高、易引起蛋白沉淀。

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