WB-考马斯亮蓝染色法

一、考马斯亮蓝结构

考马斯亮蓝R-250和G-250染料是二磺酸化三苯基甲烷化合物的两种化学形式，结构上R-250比G-250少了2个甲基。

二、蛋白质染料要求

用染料和生物大分子结合形成有色的复合物是电泳后检测常用的方法。选用染料通常应考虑以下要求：
1. 必须与大分子结合以形成一个不溶性的，有色的，紧密的复合物，但不结合到凝胶中和支持膜上，以便从凝胶中除去，否则高背景会影响蛋白带的辨别和定量扫描。
2. 染料必须容易溶解在对大分子没有影响的溶剂中，以利于背景的脱色。
3. 选用高吸光系数的染料有利于提高定量测定的灵敏度。
4. 选用能与大分子有专一性结合的染料，并在结合后能产生不同的颜色（如荧光)，可以提高检测的选择性和灵敏度。

三、考马斯亮蓝染色的应用

考马斯亮蓝又称为Bradford法，是一种常用的蛋白定性定量分析方法。其主要利用Coomassie Brilliant Blue G-250这种酸性染料与蛋白质在酸性环境下产生吸附,导致染料的最大吸光波长从465 nm变为595 nm。通过制备不同浓度的牛血清白蛋白标准品液,与Bradford试剂混合后测定其595 nm吸光度值,绘制标准曲线。与标准品同量的样品蛋白溶液与Bradford试剂混合。5 min后在595 nm波长下测定各样品与标准品的吸光度。根据标准曲线,计算出各样品的蛋白浓度。

此外，考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）与丽春红染色一样，也是WB实验中常用的染色方法。

四、考马斯亮蓝染色的步骤

（1）电泳结束后，将胶板取出放入加有超纯水的平皿中润洗，以去除残留电泳液。

（2）之后加入考马斯亮蓝染液浸没，放至水平摇床室温30 min或更长时间进行染色（具体根据凝胶厚度和温度进行调整），直至凝胶与染色液颜色十分接近。

（3）弃去染色液或回收染色液（可回收使用3次左右）。

（4）脱色直至背景清晰。

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