qPCR实验常见问题及解决方法

一、扩增曲线不稳定

可能原因

RNA纯度低；体系中存在较多杂质；仪器使用时间过长。

解决方案

1）提取高纯度的RNA，小心操作。

2）对仪器进行校准。

二、扩增无法达到平台期

可能原因

模板浓度太低；循环数太少；试剂扩增效率低。

解决方案

1) 提高模板量

2) 提高循环数

3) 用标准曲线测定扩增效率，提高镁离子浓度，换用扩增效率高的试剂。

三、荧光下降

可能原因

存在降解；模板浓度过高。

解决方案

1) 提高体系纯度

2) 降低模板量

3) 降低荧光阈值

四、单峰、峰不尖锐

可能原因

与试剂成分有关；或存在大小相近的非特异性扩增。

解决方案

1) 温度跨度不高于7度，视为可用结果

2) 进行高浓度琼脂糖电泳，确认是否为单一条带。

五、单峰，Tm低于80度

可能原因

只有引物二聚体，无目的条带；或扩增片段过短。

解决方案

1) 检查是否加入模板

2) 进行琼脂糖电泳检测，确定条带大小是否正确

六、双峰，较低峰Tm在80度之前

可能原因

由于模板浓度过低或引物浓度过高使多余引物形成引物二聚体。

解决方案

1) 适当提高退火温度

2) 提高模板量，降低引物浓度

3) 重新设计引物。

七、qPCR注意事项

·提高样品纯度，尽量减少样品之间的交叉污染。

·每个样品至少要做3个平行孔，以防在 后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。

·MasterMix不要反复冻融，如果经常使用，最好融解后放 在4℃；配置体系时在冰上操作；减少加样误差，每管或每孔都要换新枪头，不要连续用同一个枪头加样；所有成分加完后，离心去除气泡。

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