PCR实验的七大要素

　　PCR是一种能够在短时间内将单个DNA分子扩增数百万倍的生化过程。其扩增过程包括三个连续步骤：变性，对双链DNA模板进行加热，使其解离；退火，被称为引物的短DNA分子与目标DNA的侧翼区域结合；延伸，DNA聚合酶沿着模板链将引物3’端进行延伸。多年以来，PCR的基本原理一直未变，但随着 DNA聚合酶和试剂性能的大幅提升，以及仪器和塑料反应管的不断创新，PCR实验方法也在不断改进。那么你知道PCR实验的七大要素吗？让我们一起来看看吧！
 

　　一、DNA聚合酶
 

　　DNA聚合酶是PCR的重要组成部分，它们能够从单链DNA模板合成新的互补链。所有DNA聚合酶都具有5′→ 3′聚合酶活性，即掺入核苷酸并使引物从按5'至3’方向延伸。
 

　　早期的PCR，通常使用来源于 大肠杆菌 的DNA聚合酶I上的 Klenow片段 来生成新的子链。但是，这种 大肠杆菌酶对热敏感，易受到变性阶段高温度的破坏，从而无法继续进行退火和延伸步骤。因此，需要在全程每个循环的退火步骤中重新补充酶。
 

　　二、热循环仪
 

　　热循环仪是一种能够为PCR反应自动完成温度循环和孵育的仪器。在引入热循环仪之前，PCR反应是一个费时费力的过程，需在不同温度的水浴之间转移样品，并为每个步骤需要精确定时。
 

　　三、模板DNA
 

　　用于复制的PCR模板可以是任何DNA来源，如基因组DNA(gDNA)、互补DNA(cDNA)和质粒DNA。
 

　　四、引物
 

　　PCR引物是含有15-30个碱基的合成DNA寡核苷酸。能够与模板DNA中目标区域的侧翼序列结合(通过序列互补)。在PCR反应期间，DNA聚合酶从 3′端开始延伸引物。因此，引物结合位点必须是靶标附近所有的，并且与起始DNA的其它部分序列具有最小的同源性，以确保目的片段的特异性扩增。
 

　　五、脱氧核苷三磷酸(dNTP)
 

　　dNTP由四个基本核苷酸组成——dATP、dCTP、dGTP和dTTP——是新DNA链的组成元件。这四种核苷酸通常以相等摩尔量加入到PCR反应体系中，以实现最佳的碱基引入。但是，在某些情况下，如通过PCR方法进行随机突变，偶尔也会使用浓度不等的dNTP，以促进非校正DNA聚合酶产生更多的错误碱基插入。
 

　　六、镁离子(Mg2+ )
 

　　镁离子(Mg2+ )作为DNA聚合酶活性的辅助因子，有助于聚合期间dNTP的结合。酶活性位点处的镁离子可催化引物的3′-OH与dNTP的磷酸基团间形成磷酸二酯键。此外， Mg2+  能够稳定磷酸盐骨架上的负电荷，从而促进引物与DNA模板形成复合物
 

　　七、缓冲液
 

　　PCR缓冲液能够为DNA聚合酶活性提供适宜的化学环境。缓冲液pH通常为8.0-9.5，一般使用Tris-HCl来调节。
 

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