逆转录酶怎么选？

　　逆转录酶(Reverse Transcriptase)是一种用于从RNA模板生成互补DNA(cDNA)的酶，是cDNA合成和RT-qPCR反应中的核心酶，其合成的cDNA可以直接作为PCR,qPCR，LAMP和测序等检测的模板。那么你知道该如何选择逆转录酶吗？让我们一起来看看吧！

　　一、逆转录酶活性

　　逆转录酶主要包括以下三种活性：

　　①逆转录活性：以RNA为模板，催化dNTP聚合，生成DNA-RNA杂合双链。

　　②RNase H活性：水解杂合双链中的RNA，得到与RNA互补的DNA单链（cDNA）。

　　③DNA指导的DNA聚合酶活性：以cDNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成双链DNA。

　　二、决定最佳逆转录酶的几个关键重要特性

　　1.热稳定性

　　耐高温能力是cDNA合成的一个重要方面，因为高温有助于使具有强二级结构和/或高GC含量的RNA变性，从而实现全长cDNA合成和更高产量。

　　野生型MMLV逆转录酶在37°C下表现最佳，而加工改造后的热稳定性MMLV逆转录酶可以承受高达55°C的温度，而不会对逆转录效率产生负面影响。

　　2.RNase H活性

　　RNase H(核糖核酸酶H)是一种切割并降解RNA-DNA杂交链中RNA链的酶，同时可以保持DNA链的完整。

　　如果逆转录酶的RNA酶H活性过高，则会导致RNA模板的过度降解，引起cDNA合成不完整或效率低下。具有低RNase H活性的逆转录酶可以最大限度地减少反应中RNA分子的非特异性降解，提高cDNA合成的特异性和保真度。

　　由于RNA模板在全长逆转录完成之前可能被降解，RNase H活性是长片段cDNA合成过程中需要规避的因素。RNase H活性还可能会与逆转录酶中的活性聚合酶竞争从而降低逆转录效率。为了更好地合成cDNA，通过在逆转录酶的RNase H结构域中引入突变，逆转录酶的RNase H活性降低甚至完q消除。这种突变常常可以增加长链cDNAs的产量，促进其合成。

　　3.持续合成能力

　　持续合成能力是指在酶的单个结合事件中掺入的核苷酸数量。持续合成能力强的逆转录酶可以在更短的反应时间内合成更长的cDNA链。大多数经过改造的逆转录酶具有更强的合成能力(比野生型MMLV逆转录酶高65倍)。

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