免疫荧光实验的步骤有哪些？

免疫荧光（IF）是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项检测技术。可用于检测和识别细胞和组织中蛋白质及其他分子的亚细胞分布和迁移。那么你知道免疫荧光实验的步骤有哪些吗？让我们一起来看看吧！

一、细胞准备

对于单层生长的细胞，将细胞接种到预先处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，用PBS洗涤两次。

对于悬浮生长的细胞，取对数生长的细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm, 5min）两次，然后用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。

二、固定

根据需要选择适当的固定剂来固定细胞。

固定完毕后的细胞可置于含有叠氮纳的PBS中，在4℃保存3个月。用PBS洗涤3次，每次洗涤5分钟。

三、通透

对于使用交联剂（如多聚甲醛）固定的细胞，一般需要在加入抗体之前进行通透处理，以确保抗体能够到达抗原部位。选择通透剂时应充分考虑抗原蛋白的性质。通透时间一般在5-15分钟。通透后用PBS洗涤3次，每次洗涤5分钟。

四、封闭

使用封闭液对细胞进行封闭处理，时间一般为30分钟。

五、一抗结合

在室温孵育1小时或者在4℃过夜。用PBST洗涤3次，每次冲洗5分钟。

六、二抗结合

对于间接免疫荧光，需要使用二抗。在室温避光孵育1小时。用PBST洗涤3次，每次冲洗5分钟，然后再用蒸馏水洗涤一次。

七、封片及检测

滴加一滴封片剂，然后封片，最后使用荧光显微镜进行检查。

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