流式细胞仪的常见问题有哪些？

流式细胞仪(flow cytometry，FCM)作为一种强大的单细胞分析工具，可以对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒同时进行多参数、快速定量分析和分选的高新技术。那么流式细胞仪的常见问题有哪些呢？让我们一起来看看吧！

一、抗体孵育时间过长会影响检测结果吗？

通常情况下，标记细胞表面抗原的荧光抗体需要在室温孵育20-30分钟。

对于一些状态较脆弱的细胞（例如从组织中分离、培养的免疫细胞），切勿过长时间孵育，同时建议使用染色缓冲液（Staining Buffer），其中主要成分为PBS，叠氮钠和胎牛血清，胎牛血清可以减少抗体的非特异性结合，叠氮钠可以维持细胞表面抗原的稳定性。

对于胞内或者核内标记抗体，可以在固定、破膜后适当延长孵育时间，或者破核膜同时孵育核内抗体。

二、样本不能及时上机检测，血样和组织样本的保存方法？

通常情况下建议样本处理至表面抗体孵育结束，再用1%多聚甲醛重悬固定4℃保存至下一步，或者4%多聚甲醛固定10分钟后洗去，用StainingBuffer重悬，4℃保存至下一步，48小时内上机检测。如不具备前处理条件，外周血可以使用流式专用保存管存放，组织样本剪成小块后用保存液存放，建议不错过3天进行前处理和上机检测。

三、流式细胞仪测细胞周期，各个周期峰分不开，只有一个宽峰是为什么？

①如果是持续出现这种情况，说明仪器的PI检测通道CV值过高，管路需要深度清洁或者更换。

②前处理过程中出现的问题，如：乙醇固定条件（浓度、时间）的改变造成通透不wan全、RNA没有处理wan全、通道CV较差同时受到异倍体干扰等。

③如果个别组出现此情况，可能是受到实验处理条件的影响，如：转染的荧光干扰、集中在周期区间的抑制、对细胞影响过大等。

四、钙离子（Ca2+）流式检测如何设置对照？

Ca2+检测通常使用Fluo-3、Fluo-4等荧光探针，这类探针通常会在活细胞内与钙离子结合发出荧光，进行相关成像或流式检测。因此钙离子检测会有静态检测和动态检测两种方法。

静态检测主要用于检测相对胞内浓度变化，需要设置空白对照、阴性对照、阳性对照，以相对的方式检测荧光值。

动态检测主要用于检测钙动员的情况，监测加入刺激剂后的Ca2+变化情况。通常用于检测一些免疫细胞，也可以用于分析不同淋巴细胞亚群的变化情况。

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