一抗和二抗如何选择？

一、一抗的有关介绍

1. 概念

   一抗（primary antibody）作为一种免疫球蛋白，能够特异性结合特定蛋白并将其纯化、检测和定量。使用小鼠、大鼠、山羊、兔子以及其他动物作为寄主，可将一抗培育成多克隆（pAb）或单克隆抗体（mAb）。
   

2. 实验中的考虑因素

   （1）实验种属和类型的确定

         ※明确实验中的样本种属：如人、鼠、兔等，应该选择物种相同或有交叉反应的抗体。

         ※明确实验类型：如WB、ELISA、IHC、ICC、FCM 分析等，一般抗体说明书会明确说明该抗体经试验验证适用或不适用于何种分析类型，如未提及也并不意味着该抗体不适用于此种分析应用类型，而是说明尚未经过此种分析试验验证。

   （2）抗体的类型

        ※单克隆抗体：由单一B淋巴细胞分泌产生的仅识别某一特定抗原表位的、高度均一的抗体。单抗实验过程中可产生极少或无背景染色，同时也可减少与非目的蛋白的交叉反应。

        ※多克隆抗体：由多个B细胞克隆产生，针对于抗原几个表位的多种抗体混合物。多抗可识别出抗原的微小变异，能产生更强大的抗原检测信号，是涉及变性蛋白质实验首xuan抗体。

3. 分析样本蛋白的结构性质

   选择最合适的抗体还需要分析了解样本蛋白的结构性质，抗体说明书中也有相关免疫原的描述。如检测的是蛋白片段或者特殊的同型物又或是蛋白全长的某一个区域，那么则必须选择用含有此片段域的免疫原制备的抗体。
   

4. 抗体宿主物种的选择

   一般在用偶联的二抗结合无偶联物的一抗时，一抗宿主动物的物种选择就较为重要。对于IHC而言，应尽可能得选择与样本不同种系物种的一抗，从而可以避免二抗与样本内源性免疫球蛋白产生的交叉反应。比如：检测小鼠样本蛋白，则不要选择小鼠或大鼠源的一抗，最好选择兔源的一抗，那二抗则可选择偶联了检测分子（酶、荧光素、生物素等）的抗兔IgG。

   如果选择有偶联物的一抗则不适用上述情况，除IHC外的其它不含内源性免疫球蛋白样本的检测方法，则抗体宿主物种的影响不大。

二、二抗的有关介绍

1. 概念

   二抗（secondary antibody）可以直接和与靶抗原连接的一抗结合。在一抗与抗原结合后，标记的二抗特异性的结合一抗的Fc端。利用这种相互作用可以使二抗间接地进行检测和纯化靶蛋白（抗原）。
   

2. 实验中的考虑因素

   （1）种属来源
   

    一般会根据一抗的种属来源来选择相应的抗该物种的二抗。比如：一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗则应该是抗小鼠的二抗（山羊或是兔抗小鼠）。

   （2）抗体亚型

         多克隆抗体一般主要是IgG类免疫球蛋白，相应的二抗为抗IgG抗体；单克隆抗体由于存在不同的亚型和类别，选择二抗时需要根据一抗的类型或亚类相匹配。

   二抗又分为完整抗体和抗体片段两种，根据实验来决定使用哪种，主要包括IgG分子完整抗体、Fab片段以及F(ab’)2片段。

   tips:

      ※较小的抗体片段能够更高效地渗透组织，有利于IHC及IF等实验应用；

      ※采用抗体片段可以减少抗体Fc 部分与细胞上Fc受体之间的非特异性结合，可用于分析Fc受体含量高的特定组织（例如脾）。

   （3）种属来源

         二抗的选择还与偶联的标记物有关系，二抗可以偶联不同的标记物如酶、荧光素、生物素及同位素等，形成不同的标记抗体。

         偶联物的选择会对抗体灵敏度产生极大的影响；生物素偶联物、聚合物的酶促偶联物或荧光偶联物有利于放大信号。