分子生物学技术的又一次进阶

Nature报道了一项新的技术——新型核糖体，通过控制细胞合成蛋白质的过程，让人们更好地理解蛋白质的合成过程。

核糖体是一种细胞器，细胞利用核糖体转录mRNA的信息，从而将氨基酸翻译成蛋白质。试想，如果核糖体被改造，将会发生什么？伊利诺斯大学生化学家AlexanderMankin与西北大学生化学家Michel Jewett 联手制造出新型核糖体，并且这种核糖体zui大的优势在于可以根据需要改变其原有的工作方式。

每个核糖体都是大、小两个亚基组成的不规则颗粒，不同的大小亚基有多种结合方式，其可变性也很高。两位学者根据这种大小亚基结合的多变性，通过RNA将大小亚基连接。经过长时间的研究发现，这种通过RNA将大小亚基结合的结构可以在细胞内稳定存在数月，并且这种核糖体亚基能够维持细菌缓慢生长，证明这种合成的核糖体亚基与天然的核糖体可并行发挥作用。

这一发现开启了分子生物学的新纪元，在未来或许可以制造出新型的抗生素。

WesternBlot操作

1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation) 
      使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提。

需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。
2. 电泳(Electrophoresis) 
(1) SDS-PAGE凝胶配制 
      SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用 SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。 
(2) 样品处理 
      在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。92℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。 
(3) 上样与电泳 
     冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。  
     电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的电泳仪就可以满足要求，为了电泳方便起见，也可以采用整个SDS-PAGE过程恒压的方式，通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为90－120分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。
     通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
3. 转膜(Transfer) 
     我们推荐在Western实验中选用PVDF膜(FFP36/FFP39)。硝酸纤维素膜(NC膜)(FFN06/FFN09)也可以使用，但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤。 
     通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为300-400mA，转膜时间为30-60分钟。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。
     在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。 
     转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量zui大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春红染色液(P0022)对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液(P0017)对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。 
4. 封闭(Blocking) 
     转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。 
     加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。对于一些背景较高的抗体，可以4℃封闭过夜。
5. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 
     参考一抗的说明书，按照适当比例用Western一抗稀释液稀释一抗。 
洗净封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果不佳，可以4℃缓慢摇动孵育过夜。或更据抗体的说明选择适当的孵育温度和时间。
     回收一抗。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。洗净洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。 
 6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 
     参考二抗的说明书，按照适当比例用Western二抗稀释液稀释荧光标记的二抗。 二抗需根据一抗进行选择，例如，一抗是小鼠来源的IgG，则二抗需选择抗小鼠IgG的二抗，如辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)。洗净洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。 
     回收二抗。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

7、荧光显微镜下观察荧光